近期，Chin Chem Lett在线刊发了山西大学阴彩霞教授和霍方俊教授合作的文章，题目：Rapid and specific fluorescent probe visualizes dynamic correlation of Cys and HClO in OGD/R，DOI：10.1016/j.cclet.2024.109778.

为了研究活性氧和活性硫这两种信号分子在氧化应激中的相关性和病理生理效应，本研究开发了一种双通道荧光探针HP，用于单独和连续地检测Cys和HClO。该探针可同时监测细胞中Cys和 HClO 的浓度变化，具有反应速度快、灵敏度高和选择性高等特点，探针HP成功地观察了氧-葡萄糖剥夺/再灌注（OGD/R）模型HeLa细胞中HClO与Cys介导的氧化还原状态的动态变化，并动态监测了LPS诱导的腹膜炎小鼠中的内源性 HClO水平波动。

【工作亮点】

1. 作者开发了一种双通道荧光探针HP，用于单独和连续地检测 HClO 和 Cys。2. 该探针能迅速地对HClO 和Cys产生不同荧光信号，灵敏度高，选择性好。尤其是该探针对 Cys 具有良好的特异性。

3. 该探针能监测活细胞中 HClO 和Cys 介导的氧化还原平衡以及小鼠腹膜炎中 HClO 水平波动。

【研究背景】

细胞内氧化还原稳态在病理生理领域具有不可或缺的重要地位。为了维持细胞内氧化还原状态的平衡，活性氧（ROS）和活性硫（RSS）之间相互反应和转化，它们的水平也直接反映了氧化应激和疾病的程度。Cys 和 HClO 通常共存于生物体内，在许多重要的生理过程中相互影响，并协同维持体内的氧化还原动态平衡。想要了解这两种信号分子在氧化应激中的相关性和病理生理效应，需要独特的荧光成像工具。目前已开发出许多用于检测HClO或Cys的灵敏且具有选择性的荧光探针。然而，这些荧光探针无法满足同时检测HClO、Cys和 HClO/Cys 的需求，虽然我们可以使用两个单独的荧光探针来同时检测两种分析物，但简单地将两个探头混合在一个系统中的解决方案会使实现同步传感的仪器设置变得复杂，并有可能降低荧光成像的时间分辨率。此外，两种组合探针在体内往往具有不同的化学和生物特性，如定位和漂白，通常会产生相互干扰，从而影响检测效果，有时甚至无法进行定量分析。因此，开发具有独立信号单元的双响应探针是解决这一问题的有效策略。

【图文解析】

阴彩霞课题组设计合成了一种双位点荧光探针HP, 用于单独和连续地检测Cys和HClO。探针HP是用乙二胺连接香豆素衍生物和亚甲基蓝衍生物合成的，探针中的α,β-不饱和酮是Cys的反应位点，酰胺键是HClO的反应位点。探针HP与HClO反应后，亚甲蓝荧光团被释放出来，发出强烈的近红外荧光，至于Cys，它与探针HP反应，是通过巯基对探针中的α,β-不饱和酮的亲核加成反应引起的，导致荧光发射蓝移，发出绿色荧光。此外，探针HP与HClO的反应产物可以与Cys再次发生反应，探针HP与Cys的反应产物也可以与HClO再次发生反应，从而实现对HClO和Cys的连续检测。

图1 探针HP的响应机制

首先研究了探针HP在含有50%乙腈的PBS 缓冲液（pH = 7.4）中对 Cys 和 HClO 的光学特性。在紫外吸收光谱中，随着 HClO 的不断加入，660 nm 处的最大峰和 620 nm 处的肩峰呈现出亚甲基蓝的特征吸收峰，当峰值趋于稳定后继续加入 Cys，460 nm 处的吸收峰逐渐蓝移。相应地，探针 HP 与 HClO 反应后，探针的荧光在 685 nm 处达到峰值，然后随着 Cys 的继续加入，探针的荧光发射光谱发生蓝移，495 nm 处的荧光也随着 Cys 浓度的增加而逐渐增强。相反地，当探针HP首先与Cys反应后，只观察到 460 nm波长处的吸收峰下降以及蓝移。有趣的是，随后逐渐添加 HClO，一开始并没有观察到亚甲基蓝的特征吸收峰，但 450 nm 处的吸收峰逐渐恢复到探针本身的吸收峰，然后继续添加 HClO，460 nm 处的吸收峰基本保持不变，而亚甲基蓝的特征吸收峰则显示出来。同样地，荧光光谱也显示出相同的趋势，在用 200 μmol/L Cys 预处理探针后，495 nm 处的荧光强度增加，随着 HClO 的继续加入， 495 nm 处的荧光强度降低，550 nm 处的荧光强度逐渐恢复到探针 HP 自身的荧光强度，然后，继续加入 HClO，685 nm 处开始出现荧光，并随着 HClO 的增加而增强。这些结果证实探针 HP 可以对 HClO 和Cys 产生不同的荧光信号模式。

图2 探针HP的光学测试

随后研究了探针 HP 在活细胞中的连续荧光成像能力，在连续加入 HClO 和Cys 后，两个通道都能检测到明显的荧光信号。这表明探针 HP 不仅可用于单独成像，还可用于 HClO、Cys 和HClO/Cys 在红色和绿色通道的连续成像，而且不会相互干扰。结果表明该探针具有良好的生物相容性，在可视化分辨生物活性分子方面具有实用价值。

图3 探针HP对HClO和 Cys 在 HeLa 细胞中的单独和连续地荧光成像

氧化应激是一种重要的细胞病理状态，会导致细胞氧化还原状态失衡。为了研究和评估氧化应激下 HClO 和 Cys 之间的动态相关性，构建了OGD/R 模型。与对照组相比，OGD/R 组的 HeLa 细胞显示出更亮的绿色和红色荧光。这表明在氧化应激下，活性氧 HClO 的升高伴随着 Cys 的升高，这可能与细胞的自我调节有关，是减轻氧化损伤的一种方式。

图4 探针HP对HeLa 细胞中内源性 Cys 或 HClO 的荧光成像

最后，将探针HP应用于腹膜炎小鼠模型中观察内源性 HClO的动态变化。注射5分钟后，小鼠腹部立即观察到荧光，而对照组小鼠腹部未观察到荧光，大约 30 分钟后，实验组小鼠的荧光信号达到最大值。

图5 探针 HP 对腹膜炎小鼠中内源性HClO的荧光成像